Il 15 agosto del 1581 la Contrada dell'Aquila organizza un Palio con i cavalli al quale per la prima volta partecipano le Contrade. Il 1597 sembra essere l'anno del primo palio alla tonda, quello corso introno a Piazza del Campo.
Nel 1650 viene corsa l'ultima "Bufalata" e il palio alla tonda si stabilizza come iniziativa principale delle Contrade, ben distinta dalle corse alla lunga degli aristocratici. Nel 1689 il Palio viene per la prima volta ripetuto per una seconda volta dalla Contrada dell'Istrice, che per celebrare la vittoria ne indice uno per lo stesso giorno. Di lì a poco nasce il Palio dell'Assunta, che viene svolto il 16 agosto anziché il 15, giorno nel quale si era sempre svolto tradizionalmente il palio alla lunga. Solo dal 1699, invece, viene istituita la "tratta" a sorte dei cavalli.
Risale invece al 1720 la decisione di far correre solo dieci Contrade per volta, in seguito ad alcuni gravi incidenti. Fino al 1727 le contrade riconosciute sono numerose, ma solo sedici prendono parte al Palio. Due anni dopo un'apposita Commissione presenta il rapporto dal quale prende spunto il Bando sulla "Nuova divisione dei confini tra le Contrade", fortemente voluto da Violante Beatrice di Baviera, governatrice della città. Grazie ad esso il numero delle Contrade sale a diciassette dai confini ben stabiliti, che possono tutte contare in un numero uguale di abitatori. Al giorno d'oggi tale bando sussiste ancora e non è mai stato né abrogato né modificato.
Nel XIX secolo la storia del Palio si arricchisce di nuovi connotati, in linea con il processo di unificazione dell'Italia che avrà luogo dalla metà del secolo in poi. Già dal 1848 i senesi non fanno mancare il loro appoggio alla causa dell'unità d'Italia. Forti dal punto di vista istituzionale e dal profilo economico ormai consolidato, le Contrade fondano società di mutuo soccorso che ben presto prestano la propria attenzione alle vicende extra-cittadine. Così nel 1848, nel '59 e nel '66, in occasione delle guerre d'indipendenza, il Palio viene sospeso e le Contrade si preoccupano di raccogliere soldi e provviste per i soldati. Oppure, nel 1893 organizzano proteste per scongiurare la chiusura dell'Università degli Studi. Il Palio non è rimasto indifferente nemmeno alla tragedia delle due guerre mondiali, quando subisce altre sospensioni, alle quali seguono Palii straordinari che ne celebrano la fine.