La Chiesa di Santa Margherita sorge sulla sommità di una collina, affacciandosi sul suggestivo paesaggio della campagna cortonese. Una prima struttura più piccola sorge su quel poggio già poco dopo il Mille, costruita dai monaci camaldolesi in onore di San Basilio. Santa Margherita ha vissuto i suoi ultimi anni di vita ed è morta in una stanza adiacente al retro della chiesetta, nel 1297.

Nel 1258 la Chiesa di San Basilio ha subito grandi danneggiamenti durante il saccheggio di Cortona del 1258, quando la città capitola agli Aretini, sfidati e sconfitti pochi anni prima grazie all'appoggio dell'esercito fiorentino. È stata proprio Santa Margherita, a partire dal 1288 ad adoperarsi affinché il luogo di culto potesse essere ripristinato e riaprire i battenti con il nome di Chiesa dei Santi Basilio, Egidio e Caterina d'Alessandria. All'indomani della sua morte, la santa è stata sepolta nei pressi della piccola chiesa.
La popolazione di Cortona decide perciò di comune accordo di erigere un'altra chiesa più grande a fianco di quella di San Basilio e di intitolarla a Margherita. L'opera viene affidata alla maestria di Giovanni Pisano e realizzata nei primi anni del Trecento. Nel 1330, una volta completata e consacrata, la chiesa apre le sue porte alle spoglie di Santa Margherita. Ben presto l'intero complesso prende il suo nome.
La chiesa viene successivamente arricchita di opere di vari artisti, affreschi e statue dei quali oggi rimangono solo il Cenotafio della Santa ed il rosone della facciata, mentre due sculture e una parte di affresco attribuiti al Lorenzetti sono esposti al Museo Diocesano di Cortona. Sorte comune di molte chiese del cortonese è stata quella di subire una trasformazione barocca tra settecento ed Ottocento. Nel XIX secolo il rifacimento delle chiese di San Basilio e Santa margherita è stato quasi completo ed ha risparmiato solo il coro e la seconda e la terza volta della navata centrale.
All'interno della chiesa sono collocate opere di straordinaria importanza. Si segnalano in particolare il mausoleo di marmo, della parete sinistra del transetto, e l'urna della Santa di Pietro da Cortona. Nell'altare in fondo alla navata destra si può ammirare un Crocefisso ligneo trasportato dalla chiesa di San Francesco, risalente al XIII secolo. Secondo la tradizione è quello dinanzi al quale Santa Margherita soleva pregare. Nei pressi della chiesa sono situati anche il Campanile, della metà del Seicento, e l'antico convento francescano.